Wichtiger Hinweis!

Sie befinden sich auf einer nicht mehr aktuellen Seite von mikroskopie.de. Aktualisierte und überarbeitete Informationen zur gleichen Thematik finden Sie ab sofort im Pfad durch die Lichtmikroskopie.

 

Basiswissen rund um die Fluoreszenz

 

Grundlagen der Fluoreszenzentstehung

Bei der Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge (=Anregungslicht) ist bei verschiedenen Molekülen eine gleichzeitige Emission von Licht mit größerer Wellenlänge beobachtbar. Dieses Verhalten (Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht) wird als Fluoreszenz bezeichnet. 

Bestimmte Elektronen der fluoreszierenden Moleküle absorbieren hierbei die Photonen und gelangen dadurch auf ein höheres Energieniveau. Die Elektronen können sich jedoch nicht auf diesem Niveau halten und fallen deshalb praktisch augenblicklich auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück. Dabei setzen sie die aufgenommene Energie wieder frei und es kommt zur Emission des Fluoreszenzlichts. Allerdings wird die Energie nicht nur als Licht freigesetzt. Deshalb ist das emittierte Licht etwas energieärmer als das Anregungslicht. Energieärmere Lichtstrahlung besitzt jedoch eine größere Wellenlänge und deshalb auch eine andere Lichtfarbe als energiereichere Lichtstrahlung. Für die Fluoreszenz ergibt sich hieraus die bereits eingangs erwähnte Eigenschaft (Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht), welche auch als Stokes-Regel bezeichnet wird. 

Das emittierte Fluoreszenzlicht besitzt oft eine um etwa 20-50 nm größere Wellenlänge als das Anregungslicht. Diese Differenz in der Wellenlänge zwischen den beiden Lichtarten wird als Stokes-Differenz bezeichnet.

 

Prinzip der Absorption und Emission von Licht bei der Fluoreszenz
   


 


Fluoreszenzen sichtbar machen

Fluoreszenzen sind ausgesprochen lichtschwach und werden normalerweise durch das wesentlich intensivere Licht der Beleuchtungseinrichtung eines Mikroskops überstrahlt. Bei der konventionellen Mikroskopie im Hellfeld ist deshalb von einer Fluoreszenz im Präparat nichts zu sehen.

Wegen der Stokes-Verschiebung ist es jedoch möglich, durch eine geschickte Auswahl von Filtern das helle Anregungslicht und das schwache Fluoreszenzlicht im Strahlengang des Mikroskops zu trennen. Dadurch gelangt nur noch das Fluoreszenzlicht zur Bildentstehung.

 

 

 

Die obige Animation zeigt schematisch die Anordnung für die Anregung einer Fluoreszenz im Durchlicht. Bei modernen Mikroskopen für die Fluoreszenz-Mikroskopie arbeitet man jedoch mit einem Auflichtverfahren, da hier die Fluoreszenzen heller im mikroskopischen Bild erscheinen und das Anregungslicht noch besser eliminiert werden kann. Das Grundprinzip bleibt jedoch auch bei dieser komplizierteren Anordnung gültig. 

 

Fluoreszenz in der Mikroskopie

 

In der Fluoreszenz-Mikroskopie wird unterschieden zwischen

   

Primär-
Fluoreszenz

Der grüne Blattfarbstoff (Chlorophyll) von Pflanzen fluoresziert bei Anregung mit kurzwelligem Licht von Natur aus in intensivem roten Licht. Zur Beobachtung dieser Primärfluoreszenz ist keine weitere Präparation notwendig

[ Primärfluoreszenz von Chlorophyll ]

Sekundär-
Fluoreszenz

In der Sekundärfluoreszenz werden nicht selbst fluoreszierende Objekte mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (Fluorochromierung). Ein bekannter Fluoreszenz-Farbstoff ist beispielsweise Acridinorange, durch welches Zellkerne (Chromatin und Nucleolen) bei Anregung mit blauem Licht eine grüne Fluoreszenz zeigen. Da die Fluoreszenz erst durch die Präparation mit dem Fluoreszenzfarbstoff erzeugt wird, spricht man auch von induzierter Fluoreszenz.

Immun-
Fluoreszenz

In der Immunfluoreszenz wird ein Fluoreszenzfarbstoff (meist FITC = Fluorescein-iso-thio-cyanat) mit einem Antikörper gekoppelt. Diese Antiköper können sehr spezifisch für bestimmte biologische Strukturen erzeugt werden. Die Bindung des Fluorochroms wird quasi durch den Antikörper vermittelt. Derartige Fluorochromierungen sind extrem selektiv, allerdings nicht ganz so intensiv wie bei der herkömmlichen Sekundärfluoreszenz.


 

© 2002 Christian Linkenheld