Basiswissen rund um die Fluoreszenz
Grundlagen der Fluoreszenzentstehung Bei der Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge (=Anregungslicht) ist bei verschiedenen Molekülen eine gleichzeitige Emission von Licht mit größerer Wellenlänge beobachtbar. Dieses Verhalten (Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht) wird als Fluoreszenz bezeichnet. Bestimmte Elektronen der fluoreszierenden Moleküle absorbieren hierbei die Photonen und gelangen dadurch auf ein höheres Energieniveau. Die Elektronen können sich jedoch nicht auf diesem Niveau halten und fallen deshalb praktisch augenblicklich auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück. Dabei setzen sie die aufgenommene Energie wieder frei und es kommt zur Emission des Fluoreszenzlichts. Allerdings wird die Energie nicht nur als Licht freigesetzt. Deshalb ist das emittierte Licht etwas energieärmer als das Anregungslicht. Energieärmere Lichtstrahlung besitzt jedoch eine größere Wellenlänge und deshalb auch eine andere Lichtfarbe als energiereichere Lichtstrahlung. Für die Fluoreszenz ergibt sich hieraus die bereits eingangs erwähnte Eigenschaft (Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht), welche auch als Stokes-Regel bezeichnet wird. Das emittierte Fluoreszenzlicht besitzt oft eine um etwa 20-50 nm größere Wellenlänge als das Anregungslicht. Diese Differenz in der Wellenlänge zwischen den beiden Lichtarten wird als Stokes-Differenz bezeichnet.
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Fluoreszenzen sind ausgesprochen lichtschwach und werden normalerweise durch das wesentlich intensivere Licht der Beleuchtungseinrichtung eines Mikroskops überstrahlt. Bei der konventionellen Mikroskopie im Hellfeld ist deshalb von einer Fluoreszenz im Präparat nichts zu sehen. Wegen der Stokes-Verschiebung ist es jedoch möglich, durch eine geschickte Auswahl von Filtern das helle Anregungslicht und das schwache Fluoreszenzlicht im Strahlengang des Mikroskops zu trennen. Dadurch gelangt nur noch das Fluoreszenzlicht zur Bildentstehung.
Die obige Animation zeigt schematisch die Anordnung für die Anregung einer Fluoreszenz im Durchlicht. Bei modernen Mikroskopen für die Fluoreszenz-Mikroskopie arbeitet man jedoch mit einem Auflichtverfahren, da hier die Fluoreszenzen heller im mikroskopischen Bild erscheinen und das Anregungslicht noch besser eliminiert werden kann. Das Grundprinzip bleibt jedoch auch bei dieser komplizierteren Anordnung gültig.
Fluoreszenz in der Mikroskopie
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© 2002 Christian Linkenheld