Die theoretischen Grundlagen des Phasenkontrast-Mikroskops

Das Phasenkontrast-Verfahren nutzt allerdings die entstehenden Phasendifferenzen um durch bestimmte Eingriffe im Strahlenweg des Mikroskops daraus künstlich Amplitudenunterschiede und somit Helligkeitsdifferenzen in der Zwischenbildebene zu erzeugen. Das Phasenkontrast-Verfahren basiert auf der Theorie der mikroskopischen Abbildung Ernst Abbes und wurde Anfang der 30er Jahre von Frits Zernike entwickelt. Die Bedeutung der Phasenkontrast-Mikroskopie wird unter anderem dadurch deutlich, dass Zernike für seine Arbeiten zur Phasenkontrast-Mikroskopie 1953 mit dem Nobel-Preis ausgezeichnet wurde.

Umwandlung von Phasendifferenzen in Helligkeitsunterschiede

Ausgangspunkt für die Konstruktion des Phasenkontrast-Mikroskops war die Erkenntnis, dass sich durch Manipulationen im Bereich des primären Zwischenbildes, welches in der bildseitigen Brennebene des Objektivs entsteht, das mikroskopische Bild mehr oder weniger gezielt verändern lässt. In der Phasenkontrast-Mikroskopie greift man tatsächlich hier durch eine bestimmte Konstruktion in den Strahlengang ein. Welche Eingriffe notwendig sind, soll nachfolgend erläutert werden.

Zunächst sollen die Unterschiede zwischen einem Amplituden- und einem Phasenpräparat nochmals anhand des Vektor-Modells verdeutlicht werden.

	Darstellung der Lichtwelle als Sinuskurve &  Vektordiagramm

Je größer der Unterschied im Durchmesser der beiden Kreise ist, desto stärker hebt sich eine entsprechende Objektstruktur durch Kontrastierung hervor. Die Darstellung verdeutlicht den geringen Einfluss eines Phasenpräparates auf die Amplitude des direkten Mikroskopierlichts. Durch Interferenz erfolgt lediglich eine leichte Drehung in der Phase. Um nun einem derartigen Phasenpräparat dennoch zu einer befriedigenden Kontrastierung zu verhelfen, muss man durch Eingriffe in den Strahlengang künstlich Verhältnisse erzeugen, wie sie bei einem Amplitudenpräparat anzutreffen sind. In der Praxis bedeutet dies, dass durch einen derartigen Eingriff  die Beziehungen zwischen direktem und gebeugtem Licht so manipuliert werden müssen, dass für ein Phasenpräparat ein ähnliches Vektordiagramm entsteht, wie dies bei einem Amplitudenpräparat der Fall ist. Hierzu müssen zwei Probleme gelöst werden:

• Die Phasendifferenz zwischen gebeugtem und direktem Licht muss vergleichbar einem Amplitudenpräparat auf etwa 180° vergrößert werden.

• Der extreme Amplitudenunterschied zwischen direktem und gebeugtem Licht muss reduziert werden.

	Erzeugung von Helligkeitsunterschieden bei Phasenpräparaten
Das linke Vektordiagramm zeigt die notwendigen Eingriffe auf das direkte Mikroskopierlicht: eine Drehung um 90° in der Phase, sowie eine deutliche Verminderung der Amplitude. Dieses modifizierte direkte Mikroskopierlicht interferiert in der Zwischenbildebene mit dem gebeugten Licht (rechte Abbildung). Es ist erkennbar, dass ein deutlicher Helligkeitsunterschied analog zur Situation beim Amplitudenpräparat entsteht.

Um einen Phasenkontrast zu erzielen, ist die zuvor beschriebene Veränderung des direkten Mikroskopierlichts erforderlich. Gleichzeitig darf jedoch das gebeugte Licht nicht modifiziert werden. Es ist also notwendig, das direkte und das gebeugte Licht im Strahlengang soweit als möglich zu trennen, um nur das direkte Mikroskopierlicht verändern zu können. Im Bereich des primären Beugungsbildes (hintere Objektiv-Brennebene) entsteht durch das direkte Mikroskopierlicht bekanntlich ein Bild der Lichtquelle. Modifiziert man die von diesem Lichtquellenbild ausgehenden Wellenzüge in der beschriebenen Weise, so erhält man nach obiger Abbildung das modifizierte direkte Licht. Man bringt nun ein Plättchen im Bereich der Objektiv-Brennebenen in den Strahlengang ein, auf dem ein Medium aufgedampft ist, welches das Licht schwächt und gleichzeitig einen Phasenverzug von zusätzlich 90° erzeugt. Dazu wird gerade eine so große Fläche auf dem Plättchen bedampft, dass gerade das gesamte Lichtquellenbild überdeckt wird. Dieses Lichtquellenbild ist nach dem Modell der konjugierten Ebenen gleichzeitig ein Bild der Aperturblende des Kondensors. Diese Aperturblende ist eine Irisblende und somit verstellbar, deshalb ist auch der Durchmesser des Blendenbildes und somit des Lichtquellenbildes im primären Beugungsbild je nach Blendenöffnung unterschiedlich groß. Gleichzeitig durchläuft den Bereich des Blendenbildes auch ein Teil des gebeugten Lichts. Dieses gebeugte Licht würde somit unerwünschterweise ebenfalls - wie beschrieben - beeinflusst. Deshalb muss die Aperturblende des Kondensors für den Phasenkontrast modifiziert werden:

• das Blendenbild muss immer gleich groß sein - dies ist mit einer Irisblende nicht gewährleistet.

• das Blendenbild muss eine relativ geringe Fläche besitzen, um möglichst wenig gebeugtes Licht zu beeinflussen.

• gleichzeitig darf aus optischen Gründen (Auflösung) die Beleuchtungsapertur nicht zu niedrig sein, die Blende des Kondensors und somit deren Bild in der Objektiv-Brennebenen muss somit einen bestimmten Mindestdurchmesser haben.

Diese drei, teilweise widersprüchlichen Forderungen werden dadurch weitgehend erfüllt, dass die Aperturblende durch eine feste Ringblende ersetzt wird.

Man benötigt also für den Phasenkontrast zunächst einen Kondensor mit Ringblenden, zusätzlich müssen die Objektive verändert werden. In der Objektivbrennebene muss das Bild der Ringblende durch das auf der Phasenplatte aufgedampfte Medium überdeckt werden. Um gerade das Bild der Ringblende zu überdecken, wird der Phasenplatte der sogenannte Phasenring aufgedampft. Damit der Phasenring mit dem Bild der Ringblende zur Deckung gebracht werden kann, ist zusätzlich eine Zentriervorrichtung notwendig. Vom Mikroskopierlicht wird nur ein geringer Teil, welcher die Ringblende passiert, genutzt. Zusätzlich erfolgt eine Schwächung des direkten Mikroskopierlichts im Bereich des primären Beugungsbildes. Deswegen wird für den Phasenkontrast eine helle Lichtquelle benötigt.

Durch die Ringblende wird also das direkte Mikroskopierlicht auf eine geringe Fläche im primären Beugungsbild zusammengedrängt. Dadurch erfolgt die geforderte weitgehende Trennung von direktem Mikroskopierlicht und dem gebeugten Licht. Da der Phasenring nur das Ringblendenbild überdeckt, beeinflusst er zwar das gesamte direkte Mikroskopierlicht, jedoch nur einen kleinen Teil des gebeugten Lichts. Dieser geringe Anteil des gebeugten Lichts, welcher ebenfalls durch den Phasenring läuft, ist ursächlich für den Halo-Effekt, einer der Eigenheiten des Phasenkontrast-Bildes. Der Halo-Effekt äußert sich in hellen Lichtsäumen, welche im mikroskopischen Bild die Objektstrukturen umgeben. Durch diesen Halo-Effekt wird der Kontrast an Objekträndern verstärkt. Dies kann teilweise erwünscht sein. Bei komplexen Präparaten stören diese hellen Lichthöfe jedoch, da sie hier verwirren und die Interpretation des mikroskopischen Bildes erschweren. Das Ausmaß des Halo-Effektes ist hauptsächlich abhängig von:

• der Objektgröße

• der Breite des Phasenringes

• der Differenz zwischen den Brechungsindices von Einschlussmedium und Objekt - wobei der Halo-Effekt mit zunehmender Differenz ebenfalls zunimmt.

Will man den Halo-Effekt soweit möglich unterdrücken, so ist dies in erster Linie durch die Anpassung des Brechungsindexes des Einschlussmediums an den Brechungsindex des beobachteten Objekts erreichbar.