Lichtundurchlässige ("opake") Präparate kann man nicht mit dem bisher vorgestellten Verfahren - dem Durchlicht - untersuchen. Für derartige Objekte muss man ein so genanntes Auflichtmikroskop verwenden. Das Präparat wird hierbei von oben durch das Objektiv, das gleichzeitig als Kondensor wirkt, beleuchtet. Die Formung des Zwischenbildes erfolgt dann durch reflektiertes Licht, welches durch das Objektiv wieder in das Mikroskop gelangt. Für biologische Präparate wird ein klassisches Auflichtmikroskop in der Regel nicht benötigt weshalb es hier auch nur am Rande erwähnt wird. Eine Ausnahme stellen allerdings die inzwischen in der Biologie weit verbreiteten Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskope dar. Diese werden jedoch später gesondert behandelt.

In der Regel wird beim Auflichtmikroskop ohne Deckglas mikroskopiert. Deshalb werden hier spezielle Objektive verwendet, die für die Benutzung ohne Deckglas gerechnet sind.

	Der Strahlengang im Auflicht-Mikroskop (Version mit Unendlich-Optik)

Das Licht wird von seitlich über einen Strahlteiler eingespiegelt. Diese Strahlteiler lassen das Licht zur Hälfte passieren. Das übrige Licht wird durch dieses Bauelement in Richtung des Präparates reflektiert. Das vom Präparat kommende Licht passiert dann wiederum nur zur Hälfte den Strahlteiler in Richtung des Zwischenbildes. Der Rest wird dann zur Lichtquelle reflektiert.